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实时荧光定量PCR系统的基本原理分析介绍
点击次数:529 发布时间:2021/4/7 14:46:58

  实时荧光定量PCR系统反应指的是在PCR进行的同时,对其过程进行监测,一般简写为。实时定量PCR与终点PCR的区别在于数据可在PCR扩增过程中进行收集。在实时荧光定量PCR中,反应以循环中检测到目标扩增的时间点为特征,目标核酸的起始拷贝数越高,则会越快观察到荧光的显著增加(扩增曲线越靠近的X值越低)。相反,终点法检测测量的是PCR循环结束时累计的PCR产物量。

  实时荧光定量PCR系统的基本原理:
  在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团,这些荧光物质有其特定的波长。仪器可以自动检出,利用荧光信号积累,实时监测整个PCR进程,在PCR循环中,测量的信号将作为荧光阈值的坐标。并且引入一个——Ct值概念,Ct值是指产生可被检测到得荧光信号所需的较小循环数,是在PCR循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。

  荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的10倍。一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号,可以用于定义一个样本的Ct值。通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线,然后计算相对方程式。

  方程式的斜度可以用来检查PCR的效率,所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数,这样才能认为实验的过程和数据是可信的,使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量。实时荧光定量PCR仪都有软件,可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。